Л.В. Полежаев

Мы не задаемся целью заставить петуха испускать соловьиные трели, а соловья - кукарекать. Задача гораздо скромнее: нельзя ли переопределить видовой пищевой и поведенческий, экологический инстинкт у амфибий?

Впервые такой вопрос поставил известный немецкий экспериментальный эмбриолог Г.Гирсберг. В результате восьмилетней кропотливой работы с семью разными видами зародышей лягушек и жаб ему удалось получить очень интересные результаты, но лишь при одном сочетании видов. Он пересаживал мозг зародышей остромордой лягушки (Rana arvalis; семейство лягушковых), взятый на стадии нейрулы и смыкания нервной пластинки, на место удаленного мозга чесночницы обыкновенной (Pelobates fuscus; семейство чесночниц), и наоборот. Во всех остальных случаях трансплантат или не приживался, или "химерные" животные с чужеродным мозгом вскоре погибали из-за несовместимости тканей трансплантата и хозяина.

Как известно, лягушки и чесночницы в своем развитии проходят стадию головастиков, и в процессе метаморфоза, когда у них рассасываются хвост и жабры, сильно укорачивается кишечник и развиваются конечности, особи превращаются во взрослую форму - маленького лягушонка-сеголетку. По окончании метаморфоза лягушата всегда выходят на сушу, где питаются мушками или жучками - ловят их длинным и клейким языком. Живут они в траве и только некоторое время плавают в мелких водоемах, не питаясь. Чесночницы, напротив, все время проводят на суше, часто где-нибудь в огородах, роют в земле глубокие норы и закапываются в них, ночью выходят на поверхность и поглощают разных червей и жуков. У чесночниц на задних лапах большие пяточные бугры - ими они и роют норы. У лягушек пяточные бугры очень маленькие и для рытья не приспособлены. Подвижность этих двух видов амфибий разная: чесночницы медленно ползают на брюхе, а остромордые лягушки прыгают.

Из всех многочисленных подопытных животных удалось провести через метаморфоз только двух остромордых лягушек, которым был пересажен мозг чесночниц. Эти химерные создания по виду ничем не отличались от своих нормальных собратьев, но поведение их было необычным. По окончании метаморфоза они не выходили из воды и не прыгали, как лягушки, а подобно чесночницам ползали на брюхе, выкапывали в сыром песке довольно глубокие ямки и прятались в них. Однако так глубоко, как чесночницы, они в землю не зарывались - пяточные бугры у них оставались маленькими, как у лягушек. Таким образом, изменилось только поведение животных, а формы тела и разных органов были прежними. Наследственно обусловленный инстинкт, поведение животных контролировались мозгом.

Длительное время интереснейшие опыты Гирсберга, имеющие принципиальное значение для эмбриологов, оставались в тени. Вероятно, это было обусловлено тем, что основное внимание биологов на несколько десятилетий было приковано к эпохальному открытию Г.Шпеманом первичной индукции нервной пластинки у позвоночных. Эта проблема привлекла к себе внимание эмбриологов, гистологов, цитологов, физиологов, биохимиков и даже патологоанатомов всего мира и тем самым отвлекла их внимание от опытов Гирсберга.

Однако спустя 40 лет после его работ немецкие эмбриологи Г.Андерс и Е.Росслер заинтересовались проблемой изменения пищевого инстинкта и поведения животных при пересадке мозга. Они работали на головастиках двух видов амфибий - обитающих в Африке шпорцевой лягушки (Xenopus laevis) и карликового когтеносца (Hymenochirus boettgeri). Головастики этих представителей разных семейств отличаются по внешнему виду и особенностям поведения.

Головастики шпорцевой лягушки в два раза крупнее карликовых и поглощают пищу путем засасывания и фильтрования. Рот и глотка их ритмично сокращаются, прогоняя воду через жаберные щели и оставляя пищу во рту. У них сильно развиты жабры-верши.

Карликовые головастики - хищники. Они открывают свой трубкообразный рот только при пожирании маленьких рачков или другой пищи, имеют одну пару жаберных щелей, а жабр-вершей у них нет. Их глаза направлены вперед, и плавают когтеносцы горизонтально, а головастики шпорцевой лягушки - косо, под углом к поверхности воды.

Трансплантацию проводили на стадии нейрулы, т.е. в тот момент, когда у зародышей начинает закладываться нервная система. Реципиенту-зародышу пересаживали участок мозга донора, включающий фрагмент среднего и продолговатого мозга. В описываемых опытах у химер продолговатый мозг был от донора, а средний - от реципиента. Между нервной тканью донора (шпорцевого головастика) и реципиента (карликового когтеносца) устанавливались нормальные нервные связи: аксоны нервных клеток трансплантата врастали в ткани мозга хозяина. Эти химерные создания фильтровали пищу так же, как это делают шпорцевые лягушки. В 42% случаев они ритмично открывали рот и глотку. Наряду с этим у них сохранилась реакция хозяина, и они заглатывали маленьких рачков. К таким ритмическим движениям мышц глотки могли побудить нейроны донора. Однако под влиянием среднего мозга хозяина осуществлялась его программа с участием программы донора.

Итак, все эти опыты на взрослых лягушках и головастиках показывают, что в основном поведение животных можно переопределить, пересаживая чужеродный мозг, хотя в известной степени такой эффект может зависеть и от повреждения мозга реципиента. Отметим также, что после пересадки химерный мозг всегда претерпевает некоторые морфологические изменения, но функционирует.

Перекрестная пересадка органов или тканей у животных разных видов, родов, семейств получила название ксенотрансплантации. Методы таких ксенопластических трансформаций оказались весьма полезными при решении важных вопросов в биологии и генетике.

Среди прочих проблем биологии развития нас также заинтересовал вопрос переопределения генетически детерминированного или жестко программированного инстинкта и поведения животных. Мы решили поставить опыт на двух резко отличающихся по морфологии и поведению видах бесхвостых амфибий: травяной лягушки (R. temporaria) и шпорцевой (X. laevis), принадлежащих к разным семействам. Как головастики, так и взрослые особи этих лягушек совсем не похожи друг на друга.

Цель наших экспериментов состояла в том, чтобы понять, как изменится наследственно обусловленный характер поведения у химерных особей в результате перекрестной пересадки зачатка мозга у зародышей этих видов.

В опыте было несколько серий: неоперированные, интактные зародыши травяной лягушки - 14, из них к концу опыта осталось для учета - 9; интактные зародыши шпорцевой лягушки - 10, к концу опыта осталось - 4; зародыши травяной лягушки с пересаженным мозгом того же вида зародышей - 81, к концу опыта осталось всего 3 лягушонка. Зародыши травяной лягушки с мозгом шпорцевой - 72, к концу опыта осталось - 7; зародыши шпорцевой лягушки с мозгом травяной - 37, к концу опыта осталось 5 головастиков.

Чтобы ответить на эти вопросы, недостаточно только пересадить мозг, необходимо вырастить лягушек, т.е. провести химерных головастиков через метаморфоз до взрослой стадии. Зародышей травяных амфибий мы получали из естественной кладки икры лягушек, пойманных в окрестностях Москвы, или после искусственного оплодотворения икры. Икра шпорцевой лягушки поступала к нам из аквариумов некоторых других институтов.

Операции проводили на стадии ранней и поздней нейрулы или даже хвостовой почки. Зародышу-реципиенту травяной лягушки вживляли трансплантат, взятый от зародыша донора (шпорцевой). Трансплантат приживлялся плохо и его приходилось на 5 - 10 мин покрывать тоненькими дугообразными стеклянными капиллярами-мостиками.

Когда зародыши (реципиенты) превращались в головастиков, их кормили суспензией из растертых сухих и процеженных листьев крапивы. Химерных головастиков на стадии метаморфоза помещали в наклонно поставленные чашки Коха с крышками, нижняя часть которых заполнялась водой, а верхняя оставалась сухой. На нее из воды выходили маленькие лягушата-сеголетки - их кормили мушками- дрозофилами, которых они ловили длинным клейким языком. Эти химерные лягушата-сеголетки жили в наших опытах до двух месяцев.

Другая часть лягушат на сушу не выходила, т.е. вела себя подобно шпорцевым лягушкам, постоянно живущим в воде. Через несколько дней, оставшись без пищи, такие особи погибали. По окончании опыта всех лягушек фиксировали в 10% растворе формалина, делали анатомические и гистологические препараты, которые изучали под микроскопом.

После снятия черепной крышки можно было видеть, что в головном мозге имелись все составные части: передний мозг, промежуточный, средний (зрительные бугры), мозжечок и продолговатый мозг. Однако форма и архитектоника его несколько отличалась от нормальной, особенно это касалось среднего и заднего мозга на ранних стадиях развития. Нервная ткань травяной лягушки была пигментированной, темной, а шпорцевой лягушки, напротив, - очень светлой, бледной.

Совсем иначе развивались и проходили метаморфоз зародыши шпорцевой лягушки. Их головастики превращались в лягушат, которые оставались в воде всю жизнь. Головастиков и взрослых особей кормили трубочником. К сожалению, после пересадки зачатка мозга травяной лягушки шпорцевой не удалось получить ни одного химерного лягушонка.

Следует отметить, что главным образом из-за несовместимости тканей лягушек разного вида смертность в эксперименте была очень велика. Из 218 зародышей к концу опыта осталось 28 лягушат. Однако на результат эксперимента влияли и другие факторы, например кормление. Иногда амфибии погибали из-за повреждений во время операции промежуточного мозга.

Результаты нашего опыта позволяют сделать вывод, что, несмотря на выраженную несовместимость тканей травяной и шпорцевой лягушек, все же в некоторых случаях удается получить химерных особей при пересадке на стадии нейрулы - ранней хвостовой почки. У таких амфибий оказываются переопределены запрограммированные пищевой и экологический, поведенческий инстинкты. Было бы интересно продолжить подобные эксперименты и найти некий новый подход к проблеме. В частности, попробовать выделить из мозга зародышей и взрослых особей определенные биологически активные вещества и попытаться с их помощью повлиять на инстинкт животных. Эту идею можно проверить экспериментально и в случае успеха испытать в опытах на млекопитающих.

До сих пор речь шла о ксенотрансплантации между видами животных, принадлежащих к разным семействам. Однако успешные пересадки нервной ткани между такими особями позволили предположить, что трансплантация нейральных зачатков возможна и между животными разных классов и даже типов. Впервые функциональная и структурная совместимость нервных систем позвоночных и беспозвоночных была продемонстрирована в культуре тканей. Попытку объединить нервные системы насекомых и млекопитающих осуществила группа научных сотрудников Института биологии развития им.Н.К.Кольцова РАН (руководитель Л.И.Корочкин) и Института морфологии человека РАН (руководитель С.В.Савельев). Нервную ткань насекомого - мушки-дрозофилы, хорошо изученной генетиками, они пересаживали в нервную трубку зародышей амфибий, мышей и крыс. Исследователей прежде всего интересовало, возможно ли приживление нейральной ткани насекомого при столь отдаленном родстве животных. Впоследствии возникли и другие весьма интересные задачи в этом смелом и оригинальном исследовании.

Донором во всех опытах служил нейральный зачаток мутантной мушки Drosophila melanogaster, у которой вся вентральная (брюшная) эктодерма превращается в нейральный зачаток. Группу этих клеток с помощью тонкого стеклянного капилляра вводили в бластоцель очень ранних зародышей хвостатых и бесхвостых амфибий. Однако пересаженные клетки уничтожались фагоцитами реципиента. Тогда исследователи с помощью микроманипулятора стали вводить нервные клетки зародышей дрозофилы в замкнутую нервную трубку зародышей амфибий: сибирского углозуба (Hynobius keysererling) и шпорцевой лягушки. Опыт был успешен: в большинстве случаев пересаженная нейральная ткань мушки попадала в третий желудочек головного мозга амфибий. Там она развивалась, и между нервными клетками донора и реципиента устанавливалась тесная связь.

В последующих опытах нейральные клетки дрозофилы трансплантировали в нервную трубку амфибий (саламандр, тритонов, шпорцевых и остромордых лягушек), а также беспородным мышатам и новорожденным крысятам. После пересадки животных фиксировали в разные сроки до 6 мес и их мозг изучали под световым и электронным микроскопом.

Для хвостатых амфибий гистосовместимость между тканями донора и реципиента оказалась достаточно высокой. Без видимых морфологических изменений эмбрионы амфибий развивались в течение двух суток. За это время пересаженная ткань укреплялась на одной из стенок головного мозга реципиента. Между нейронами дрозофилы и амфибий устанавливалась связь, но через трое суток у лягушек проявлялись морфологические и гистологические аномалии: менялись форма головы и пояса передних конечностей. Хотя клетки дрозофилы могут развиваться в полноценные нейроны в нервной системе амфибий, при длительном развитии у химерных животных клетки мозга дедифференцируются. Этот феномен, видимо, объясняется тем, что продукты метаболизма дифференцированных клеток дрозофилы влияют на генетический аппарат амфибий.

Однако интересно, что трансплантированная нервная ткань дрозофилы сильно ускоряет развитие зародышей лягушки. Химерные особи на 10 - 11 дней раньше проходили метаморфоз и были крупнее обычных собратьев: экспериментальные лягушки весили на 1.5 г больше (сравниваемые группы животных брались от одних родителей).

Последствия трансплантации нейрального зачатка мутантной дрозофилы были неодинаковы у различных видов. В опытах, когда реципиентами служили мыши или крысы, большинство нервных клеток дрозофилы дифференцировалось уже через одни сутки, т.е. намного быстрее, чем в организме амфибий. Из-за этого они почти не мигрировали, около 20 - 30% клеток погибало в течение трех-четырех суток, а затем ситуация стабилизировалась. Через два месяца после пересадки у молодых крыс и взрослых мышей нервные клетки дрозофилы оставались жизнеспособными.

Таким образом, эксперименты показали, что объединение нервных систем позвоночных и беспозвоночных вполне реально. Этот вывод подтверждают следующие факторы: во-первых, функциональная интеграция нервных клеток насекомых и мозга позвоночных; во-вторых, морфологические контакты между трансплантатом и реципиентом; в-третьих, длительная жизнеспособность клеток дрозофилы, которая обеспечивает их влияние на мозг реципиента. Более того, хорошая изученность генома дрозофилы и возможность получения нужных мутаций дают основания для использования отдаленной ксенотрансплантации в медицине как инструмент целенаправленного воздействия на поведение и компенсации функций мозга.

Такие эксперименты и были начаты в 1994 г. группой Л.И.Корочкина совместно со специалистами из Института морфологии человека, а также из Института Склифософского (руководитель В.В.Лебедев).

Известно, что болезнь Паркинсона у людей пытались лечить с помощью трансплантации эмбриональной, или фетальной (т.е. взятой от плода), ткани, выделенной из надпочечника или мозга человека, полученных при аборте. Напомним, что паркинсонизм выражается в дрожании (треморе) и напряженности (ригидности) рук, трудности движений, потом в обездвижении и в заключение - смерти.

Результаты трансплантаций фетальных тканей человека в мозг пациентов показали невысокую эффективность такого подхода: явный терапевтический эффект достигался только в 3 - 5% случаев, хотя состояние больных улучшалось значительно чаще.

Клиническая модификация таких операций (поиск оптимальных зон для введения в мозг трансплантатов, разработка новой технологии пересадок, использование кратковременных клеточных культур, применение новых тканей и стимуляция приживления трансплантата с помощью различных ростовых факторов) не принесла желаемых результатов. Положительный эффект достигался только в 2.5% случаев, причем через 6 - 12 мес после операции он постепенно снижался.

Исследователи решили попробовать лечить паркинсонизм пересадкой смешанных фетальных человеческих и ксеногенных (дрозофильных) тканей. Наблюдения над больными в этих случаях проводили от 6 до 12 мес.

Для трансплантации брали ткани плодов человека, полученных после аборта между 14 и 16 неделями, выделив участки из вентральной части среднего мозга и базальных ганглиев переднего мозга. До операции эту фракцию держали один-три дня в жидком азоте, чтобы сохранить морфологическое строение и биохимические свойства ткани. Зная, что нервные клетки мутантов дрозофилы ускоряют развитие нейробластов животных и стимулируют васкуляризацию (т.е. развитие питающих их кровеносных сосудов), одновременно с пересадкой фетальной ткани в мозг человека трансплантировали нейрогенную ткань дрозофилы. Смесь фетальной ткани и ксенотрансплантата (в соотношении от 1000:20 до 1000:1) вводили в вентралатеральное ядро зрительного бугра, в точно локализованную область.

В одном случае больная 43 лет страдала паркинсонизмом в течение восьми лет. Ей пересадили вентральное ядро зрительного бугра, через 10 мин ввели фетальную и ксеногенную смесь. Сразу же пропали и тремор и ригидность левых конечностей. Через 9 мес. сделали вторую операцию, а через 12 мес. признаки паркинсонизма исчезли.

Во втором случае 49-летнему пациенту, болевшему паркинсонизмом уже семь лет, провели сходное лечение. За 6 мес. наблюдения рецидива паркинсонизма не наблюдалось.

В третьем случае больной 60 лет, страдавшей двусторонними ригидно-дрожательными явлениями в течение 10 лет, была сделана такая же операция. Положительный эффект наступил не сразу, а только через 2 мес. и сохранялся в течение 7 мес.

В ходе исследования проводились два типа операций, отличающихся по технике трансплантации. При сочетании криодеструкции тканей мозга с пересадкой терапевтический эффект проявлялся сразу после операции. По-видимому, это связано с разрушением тканей мозга холодом. Эффект действия ксенотрансплантации наблюдается только через 1.5-2 мес после операции, когда фетальные ткани под стимулирующим влиянием трансплантата дифференцируются и их активность сказывается на состоянии пациента.

Подводя итоги, можно сказать, что разработанный подход может быть более эффективным при лечении паркинсонизма, чем применявшийся ранее. Использование нейрогенных закладок различных мутантов и рас беспозвоночных с заданными и уже исследованными свойствами весьма перспективно для медицинской практики. Однако целый ряд проблем требует дальнейшей разработки. В первую очередь это касается выделения большого количества нейрогенных закладок и их хранения. Решение этих задач позволит дать более глубокий анализ нового метода лечения паркинсонизма.